Temperatura de alineamiento PCR

Usa esta calculadora de temperatura de alineamiento PCR para estimar la temperatura de fusión del cebador (Tm) y una temperatura inicial de alineamiento (Ta). El cálculo utiliza la secuencia del cebador, el contenido de GC y una concentración aproximada de sodio monovalente (Na+).

Se proporcionan dos estimaciones simplificadas de Tm. El método de Wallace estima el Tm a partir del número de bases A, T, G y C. La estimación ajustada por sal también tiene en cuenta la concentración de sodio en la reacción. Para cebadores de hasta 13 nucleótidos, la calculadora utiliza la estimación de Wallace para determinar la Ta sugerida; para cebadores más largos, utiliza la estimación ajustada por sal. La temperatura de alineamiento sugerida se establece 5 °C por debajo de la estimación de Tm seleccionada.

Estas fórmulas son aproximaciones empíricas y deben utilizarse como punto de partida, no como predicciones termodinámicas exactas. El rendimiento real de la PCR también depende de la concentración de los cebadores, Mg2+, dNTP, composición del tampón, concentración del molde, desajustes, formación de dímeros de cebadores, estructuras secundarias y otras condiciones experimentales. Usa el resultado como punto de partida para optimizar la PCR, no como una temperatura óptima garantizada.

Secuencia del cebador: Introduce una secuencia de cebador de ADN o ARN en dirección 5′ → 3′. Los espacios y otros caracteres no alfabéticos se eliminan antes de la validación. Se aceptan las bases A, C, G, T y U. Para el cálculo de Wallace, U se trata como T; el contenido de GC cuenta únicamente G y C.

Sal (mM Na+): Introduce la concentración aproximada de sodio monovalente en la mezcla de reacción, expresada en milimolar (mM). La calculadora convierte este valor a concentración molar antes de aplicar la fórmula ajustada por sal. El valor predeterminado es 50 mM.

Longitud: Número de nucleótidos (nt) de la secuencia del cebador una vez eliminados los caracteres no válidos.

GC (%): Porcentaje de nucleótidos G y C presentes en la secuencia del cebador.

Tm Wallace (°C): Estimación simplificada de la temperatura de fusión calculada como 2 × (A + T) + 4 × (G + C), considerando U como T.

Tm ajustado por sal (°C): Estimación simplificada de la temperatura de fusión que incorpora la concentración de sodio monovalente introducida.

Ta sugerida (°C): Temperatura inicial de alineamiento PCR, calculada como 5 °C por debajo de la estimación de Tm seleccionada por la calculadora.