Temperatura di annealing PCR

Usa questo calcolatore della temperatura di annealing PCR per stimare la temperatura di melting del primer (Tm) e una temperatura iniziale di annealing (Ta). Il calcolo utilizza la sequenza del primer, il contenuto di GC e un'approssimazione della concentrazione di sodio monovalente (Na+).

Vengono fornite due stime semplificate del Tm. Il metodo di Wallace stima il Tm in base al numero di basi A, T, G e C. La stima corretta per il sale tiene conto anche della concentrazione di sodio nella reazione. Per primer fino a 13 nucleotidi, il calcolatore utilizza la stima di Wallace per determinare la Ta suggerita; per primer più lunghi utilizza la stima corretta per il sale. La temperatura di annealing suggerita viene impostata a 5 °C al di sotto del Tm selezionato.

Queste formule sono approssimazioni empiriche e devono essere considerate come un punto di partenza, non come previsioni termodinamiche esatte. Il comportamento reale della PCR dipende anche dalla concentrazione dei primer, da Mg2+, dNTP, composizione del buffer, concentrazione del template, mismatch, formazione di primer-dimeri, strutture secondarie e altre condizioni sperimentali. Usa il risultato come punto di partenza per l'ottimizzazione della PCR, non come temperatura ottimale garantita.

Sequenza del primer: Inserisci una sequenza di primer DNA o RNA in direzione 5′ → 3′. Gli spazi e gli altri caratteri non alfabetici vengono rimossi prima della validazione. Sono accettate le basi A, C, G, T e U. Nel calcolo di Wallace, U viene considerata come T; il contenuto di GC considera invece solo G e C.

Sale (mM Na+): Inserisci la concentrazione approssimativa di sodio monovalente nella miscela di reazione, espressa in millimolare (mM). Il calcolatore converte il valore in concentrazione molare prima di applicare la formula corretta per il sale. Il valore predefinito è 50 mM.

Lunghezza: Numero di nucleotidi (nt) presenti nella sequenza del primer dopo la pulizia della sequenza.

GC (%): Percentuale di nucleotidi G e C presenti nella sequenza del primer.

Tm Wallace (°C): Stima semplificata della temperatura di melting calcolata come 2 × (A + T) + 4 × (G + C), considerando U come T.

Tm corretto per il sale (°C): Stima semplificata della temperatura di melting che tiene conto della concentrazione di sodio monovalente inserita.

Ta suggerita (°C): Temperatura iniziale di annealing PCR, calcolata come 5 °C al di sotto della stima di Tm selezionata dal calcolatore.