Temperatura de anelamento PCR

Use esta calculadora de temperatura de anelamento PCR para estimar a temperatura de fusão do primer (Tm) e uma temperatura inicial de anelamento (Ta). O cálculo utiliza a sequência do primer, o conteúdo de GC e uma concentração aproximada de sódio monovalente (Na+).

São fornecidas duas estimativas simplificadas de Tm. O método de Wallace estima o Tm com base no número de bases A, T, G e C. A estimativa ajustada pelo sal também considera a concentração de sódio na reação. Para primers de até 13 nucleotídeos, a calculadora utiliza a estimativa de Wallace para determinar a Ta sugerida; para primers mais longos, utiliza a estimativa ajustada pelo sal. A temperatura de anelamento sugerida é definida 5 °C abaixo da estimativa de Tm selecionada.

Estas fórmulas são aproximações empíricas e devem ser usadas como ponto de partida, não como previsões termodinâmicas exatas. O desempenho real da PCR também depende da concentração dos primers, Mg2+, dNTPs, composição do tampão, concentração do molde, incompatibilidades, formação de dímeros de primers, estruturas secundárias e outras condições experimentais. Use o resultado como ponto de partida para otimizar a PCR, não como uma temperatura ótima garantida.

Sequência do primer: Insira uma sequência de primer de DNA ou RNA na direção 5′ → 3′. Espaços e outros caracteres não alfabéticos são removidos antes da validação. São aceitas as bases A, C, G, T e U. No cálculo de Wallace, U é considerada como T; o conteúdo de GC considera apenas G e C.

Sal (mM Na+): Insira a concentração aproximada de sódio monovalente na mistura de reação, expressa em milimolar (mM). A calculadora converte esse valor para concentração molar antes de aplicar a fórmula ajustada pelo sal. O valor padrão é 50 mM.

Comprimento: Número de nucleotídeos (nt) presentes na sequência do primer após a remoção dos caracteres não válidos.

GC (%): Percentual de nucleotídeos G e C presentes na sequência do primer.

Tm Wallace (°C): Estimativa simplificada da temperatura de fusão calculada como 2 × (A + T) + 4 × (G + C), considerando U como T.

Tm ajustado pelo sal (°C): Estimativa simplificada da temperatura de fusão que incorpora a concentração de sódio monovalente informada.

Ta sugerida (°C): Temperatura inicial de anelamento PCR, calculada como 5 °C abaixo da estimativa de Tm selecionada pela calculadora.